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牛上皮細胞抗菌肽的分離純化

更新時間:2010-10-27      點擊:1780

牛抗菌肽共有13種,主要包括[5-6]牛β-防御素上皮抗菌肽、舌抗菌肽、腸上皮細胞抗菌肽,即腸肽素及牛肽聚糖識別蛋白)  Diamond G等[7]從牛氣管黏膜分離得到TAP,它是從哺乳動物上皮細胞分離純化得到的*個抗菌肽,TAP的發現為其他的哺乳動物上皮細胞抗菌肽的發現奠定了堅實的基礎。Tarver A P等[8]從牛小腸分離純化得到牛腸肽素,其方法為采集牛小腸,液氮凍存,-70 ℃保存備用。

    粗提制備:剪碎,研磨,勻漿,用100 mL/L乙酸過夜攪拌浸提,過濾,液體用1 mol/L硫酸銨沉淀,離心,上清液濃縮即得粗提。純化采用3步色譜技術,*步凝膠過濾色譜,生物凝膠P-30,排阻極限40 ku),2. 0 cm×30 cm 的柱子,用50 mmol/L的乙酸銨(pH 4.1)平衡、2.5 mL/min流速洗脫,收集、冷凍干燥并做抑菌試驗。

     有活性部分進行陽離子交換色譜,用330 g/L KH2PO4溶液平衡,0 mol/L~1 mol/L的NaCl線性梯度洗脫,收集冷凍干燥。將有抗菌活性的部分進行第三步分離純化,反相高壓液相色譜,0.46 cm×22 cm C18反相柱,平衡1 mL/L三氟乙酸(TFA)水溶液,洗脫1 g/L TFA/乙腈,乙腈梯度0 mL/L~850 mL/L,洗脫速度1 mL/min,收集進行活性檢測、分子量鑒定及序列測定。  
    
     Aono S等[9]從牛乳腺上皮細胞克隆到一種新的牛β-防御素,并進行真核細胞表達。重組表達蛋白用CM Macro-Prep樹脂進行純化,純化抗菌肽進行質譜分析,氨基酸測序。BPGRPs的純化則先將粗提產物采用10 cm× 25 cm C18 catridge進行濃縮,再用RP-HPLC進行純化,平衡1 mL/L TFA水溶液,洗脫1 mL/L TFA/乙腈,乙腈梯度0 mL/L~420 mL/L[10]。

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